实时PCR可检测出大部分遗传变异

发布日期:2017-10-02

在RT-PCR中,首先把RNA用逆转录酶逆转录成互补DNA(cDNA),然后通过常规PCR或实时荧光定量PCR扩增cDNA。RT-PCR可以用于检测mRNA表达,基因融合和RNA病毒。出国看病找爱诺美康,RT-PCR技术在临床成功应用的一个例子,是美国食品与药物监督管理局(FDA)批准的Oncotype DX试剂盒,它通过检测一组21个基因的RNA表达来量化乳腺癌复发的可能性,并预测其从某些类型的化疗方案中可能的获益。

此外,RT-PCR已被广泛用于检测染色体易位相关的基因融合。与常规PCR相比,利用RT-PCR检测融合基因的优势是其引物设计的简便性。因为易位相关的基因融合,主要发生在融合点多变的内含子区,常规PCR中就需要设计多对引物来检测不同的融合区域。然而,在RT-PCR中引物的设计目标是两个融合的外显子,而内含子区在剪接过程中被切除。


因此,用RT-PCR检测融合基因是一种比常规PCR更实用的方法。如果将FFPE组织作为RNA来源的话,很重要而且值得注意的是RNA的降解,扩增子的大小应小于150bp。快速扩增cDNA末端(RACE)是一种特殊类型的RT-PCR,当已知融合转录本的一个易位伙伴基因时,可用于获得mRNA的全长序列。

出国看病找爱诺美康,该方法已成功地应用于识别前列腺癌中基因的易位伙伴基因。实时定量PCR,允许研究人员“实时”监控PCR定量的进展。此外,整个实验是在一个封闭的系统中进行的,不需要通过常规PCR中的电泳分离扩增子。实时PCR的仪器仪除了一个PCR热循环仪,还包括一个荧光检测器。在反应中,除了引物,还需要有荧光染料或荧光标记探针。

SYBR绿是一种常用的染料,它可结合到DNA双链上。研究人员已经开发了几种序列特异荧光标记探针(又称荧光报告基团),包括TaqMan探针(应用生物系统公司,Carlsbad,CA),分子信标探针(Cepheid公司,Sunnyvale,CA)和荣光共振能量转移探针(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)。

在实时PCR中,扩增子的量与荧光强度相关,并可通过与适当的标准品进行计算。DNA或RNA分子都可以用实时荧光定量PCR检测。当实时PCR用于检测RNA时,它被称为实时RT-PCR或RT2-PCR。出国看病找爱诺美康,实时PCR像常规—样,可以检测出大部分的遗传变异,包括点突变或单核苷酸多态性、基因缺失、融合和扩增。BCR-ABL融合基因的检测和定量是一个实时定量RT-PCR的应用实例。