美国看病:介绍人类基因组的测序技术

发布日期:2017-10-12

DNA是遗传物质并最终编码蛋白质,由4种碱基组成:腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)。碱基排列的顺序称为DNA序列,这个序列也决定着蛋白质的氨基酸序列。用于测定碱基序列的方法和技术通常被称为“测序”。在1970年代早期所获得的第一个DNA序列,使用了非常繁琐的基于二维电泳的方法。随后,技术发展并出现了基于染料的测序方法和自动化的分析,使得DNA测序过程变得简单,测序速度也提高了好几个数量级。现代化的高速DNA测序技术,已成为人类基因组测序的工具。

美国看病找爱诺美康,DNA序列的知识,已成为基础生物学研究不可或缺的东西,也在众多应用领域日渐重要。例如分子诊断、药物发现、法医学、环境科学等。测序癌症的DNA已在理解、诊断和治疗癌症上面产生了深刻的影响。最初的DNA测序技术于20世纪70年代在实验室开发出来。


Allan Maxam和Walter Gilbert开发了一种方法,基于特定碱基位点的化学修饰和DNA切割原理、尽管这一方法的优势在于可直接利用提纯的DNA,如今这一方法已不再使用,因为其技术上非常复杂,大量使用有害的化学物质,以及很难扩大规模。随后链终止法由Sanger等发明,因其可靠性和可扩展性而被广泛使用。美国看病找爱诺美康,大多数现代用于人类基因组测序的技术都基于这一方法。

这一方法使用一个单链DNA作为模板,一种DNA聚合酶,一个DNA引物,常规的脱氧核苷酸(dNTPs)和双脱氧核苷酸(ddNTPs)作为DNA链延伸的终止。传统的Sanger测序法中,DNA样品分为4个生化反应,每个反应中加人全部的4种dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP),DNA弓|物和DNA聚合酶,以及一种双脱氧核苷酸。双脱氧核苷酸(ddNTP)缺少基团,因此无法生成两个核苷酸之间的磷酸二酯键,所以可以终止DNA链的延伸。反应会产生一系列不同长度的DNA链。某一成分(引物或ddNTP)有放射性标记或荧光标记。

新合成的DNA片段,用热或化学的方法模板链上分离下来,用电泳进行解析,分辨率可高达一个核苷酸。电泳胶可用X线片放射自显影或荧光显像的方式成像,最终的DNA序列可由电泳条带所确定。Sanger测序法的过程,使用4种不同颜色荧光染料标记4种ddNTP,就可以使4个反应在一起发生。美国看病找爱诺美康,因此,可以将测序的效率增加4倍,只需要一管反应,因此测序可以更快更经济。现代的高通量自动化的一代DNA测序技术都基于此方法。

技术的进步,使Applied Biosystems公司生产并贩售了一代自动化测序仪,这些测序仪作为主力测定了人的第一个基因组。这些自动化的DNA测序仪,可以平行测序384个DNA样品,每天最多测定24轮。将一代测序仪测定出的众多小片段(一般小于500碱基)重叠起来,最终可测定出整个人类基因组。

美国看病找爱诺美康,将基因组打断成为小片段的方式,通常有限制性内切酶或机械打断。打断后的DNA片段被克隆进质粒载体,并用大肠杆菌扩增。克隆的数量必须足够多,以至于能覆盖整个基因组很多次,以获得足够的重叠片段用于拼接整个基因组、染色体或特定的测序靶区域。保护小DNA片段的质粒从单个的细菌菌落里分离出来并测序。